Ja sam na virtualnom sastanku povodom novog koronavirusa i bolesti koju on uzrokuje COVID 19. Sastanak poput ovoga normalno bi se održao ovde u kampusu CSHL sa mjesecima i mjesecima priprema. Ali ipak smo u mogućnosti da okupimo vodeće naučnike iz cijelog svijeta na virtualni sastanak i velika je privilegija i ogromna prilika slušati ih. I dok učim najnovije detalje, mislila sam da bi bilo dobro vrijeme za pregled molekularne biologije i biokemije ovog virusa, zašto ga je teže liječiti od bakterijskih infekcija, dok doktori i naučnici nastoje otkriti neku od njegovih Ahilovih peta.

Kada imate infekciju uzrokovanu bakterijama doktori mogu prepisati lijekove zvane antibiotici,koji ciljaju Ahilovu petu bakterija. Ali kada je infekcija uzrokovana virusom, manja je mogućnost za doktore da specifično tretiraju infekciju pa umjesto toga, obično se baziraju na simptomatsku terapiju poput antipiretika, ako imate povišenu temperaturu,ili kisika ako imate poteškoće sa disanjem.

Teže je ciljati prave viruse, jer ih ustvari nema mnogo samo njihov genetski materijal (virusni genom), sa nekim ʺpakovanjemʺ. Različiti virusi imaju različite kompozicije, tako je  SARS Cov-2 virus jednolančani RNA virus iz porodice Coronaviridae. Umjesto dvolančane DNK kao što mi imamo, on svoju genetsku informaciju nosi u jednolančanoj RNK zamotanoj proteinima nukleokapside, koja je obavijena membranskim omotačem građenim od proteina, šiljastih proteina koji izviruju i vežu se za receptore na ćelijama da se ušuljaju tamo gdje mogu oteti ćeliju,stvoriti dosta svojih kopija (replicirati se), izbiti iz nje i nastaviti inficirati druge ćelije. Tako podmukli, unatoč šteti koju su u stanju napraviti virusi se ne smatraju živim organizmima, jer oni zapravo ništa ne mogu učiniti sami, već se oslanjaju na stanice domaćina za osnovno funkcioniranje.

Bakterije u drugu ruku mogu biti male, ali su cijeli, živi organizmi. Jednoćelijske, da – ali to samo povećava pritisak na njih kako bi se osiguralo da svaka ćelija napravi sve što je potrebno za rast, napredak i dijeljenje – i svaka od tih kćeri ima sve što treba. Stoga mora izraditi i držati se genetskih uputa za mnogo više stvari koje nude puno više potencijalnih meta za lijekove.

Da napravimo poređenje, genom SARS-Cov-2 dugačak je samo oko 30 000 jedinica (nukleotida), bakterija E. Coli ima genom dug oko 4,6 milijuna jedinica, a naš vlastiti genom dugačak je oko 3 milijarde jedinica. Da bi svoj genom održao tako malim, virus koristi mehanizme svojih domaćinskih stanica kad god je to moguće, a mi za mehanizme  koji su nam potrebni ne možemo pružiti pametne trikove za uštedu prostora za pisanje uputa u što je manje moguće jedinica. To mu omogućuje da lakše izvrši svoju neživotnu svrhu: brzo napravi puno više kopija svog genoma, pakira ih u male pakete i otpremi ih da zaraze puno novih stanica. Budući da se sve što se događa unutar stanice, virus, uključujući njegov genom, mora biti jako mali.

Bakterijski genomi nemaju ovo ograničenje veličine, tako da mogu imati više genetskih uputa i napraviti više stvari. To uključuje izradu nekih struktura koje nemamo. Budući da bakterije nemaju kožu da se zaštite, svaka bakterijska ćelija treba biti otporna, to im omogućuje njihov ćelijski omotač koji je deblji nego kod naših ćelija.  Osim fosfolipidnih membrana koje mi imamo, bakterije imaju i

ćelijski zid sačinjen od šećera i peptida (kratki lanci proteinskih poruka). Pošto ljudska ćelija nema ćelijski zid ,on je dobra meta za antibiotike kao i enzimi koji učestvuju u njegovom stvaranju. Ovo je primjer kako pencilin, ampicilin, i β glikan vezani antibiotici rade. Ali virusi nemaju ćelijski zid, i iz ćelijske perspektive izgledaju poput susjedne ćelije jer kada virusi ʺispupaju” iz ćelije domaćina  oni su obavijeni njenom ćelijskom membranom- to nam govori da su skriveni!

Pogledajmo dalje, drugi antibiotici ciljaju druge dijelove bakterijske mašinerije poput bakterijskih ribozoma, tj. organela, sačinjenih od proteina i rRNK, važne jer igraju bitnu ulogu u sintezi proteina. Prije nego što  se protein napravi iRNK  kopira genski recept za njega. Ribozomi putuju duž ove i RNK , prateći iRNK instrukcije, koja će se amino kiselina (proteinska jedinica), dodati i na koje mjesto. Triplet nukleotida RNA- “riječi ” zvanih kodon,  prestavlja jednu aminokiselinu zajedno sa pomoćnićkom molekulom t RNK koja nosi triplet do ribozoma i veže se, (koristeći komplementarni antikodon radi specifičnosti).

Mi imamo i ribozome takođe, ali naši ribozomi su dovoljno drugačiji od bakterijskih da možemo koristiti terapiju koja će isključivo ciljati bakterijske, a našim neće naškoditi. Primjer ovog tipa je antibiotik kanamicin.

Virusi su također  oslonjeni na ribozome radi stvaranja virusnih proteina, ali koriste ribozome ćelije domaćina tako da ne postoje virusni ribozomi kao meta, tako ako ciljamo  virusno ispisivanje proteina ciljamo i naše.  Namjerno koristim ispisivanje,a ne sintezu,stvaranje, jer iako je peptidna mašinerija pisanja  ista , postoji važna razlika u stvarnju naše i virusne sinteze proteina. Pisaći proces ribozoma koristi mRNK da veže aminokiselinu u dugi polipeptid,  koji se zove translacija. I ovo je isto i kod nas i kod virusa. Ali za dosta naših proteina, polipeptid kao rezultat translacije je jedini protein ( on biva pohranjen ili podliježe posttranslacionoj modifikaciji, ali je i dalje samo jedan).  Ali virusi, sa ograničenjem da drže svoj genom super malim i zapakiranim, često pišu više proteina u jedan dugački „polipeptid“ koji potom razrežu (pomoću enzima nazvanih endoproteaza) u nekoliko proteina. Na primjer, najveći gen SARS-Cov-2 je “replikaza” gen koji sadrži upute za stvaranje proteina koje virus treba replicirati. A, u drugim svojim trikovima za uštedu prostora, virus može stvoriti 2 različita poliproteina iz ovog gena – pp1a i pp1ab. To može učiniti jer koristi ” klizeću sekvencu” i pseudo čvor (dio RNA se presavija u “blokade puta”) kako bi zaustavio ribosom na svom prijevodnom putu i natjerao ga da se pomakne, promijeni okvir čitanja  i nastavi prolaziti pored znaka  rep1 stop da bi napravio pp1ab.

Kao rezultat toga, pp1ab ima iste stvari kao pp1a, ali ima i dodatne upute za protein – pp1a ima nsps 1-11, a pp1ab nsps 1-16. Nsps označava nestrukturne proteine i nazivaju ih tako da ih razlikuju od virusnih strukturnih proteina (uključujući bjelančevine proteina, S; protein ovojnice, E; membranski protein, M; i nukleokapsidni protein, N) – koji su važni za pakiranje virusnog genoma i dopremanje do novih stanica. Ti strukturni proteini (i nekolicina drugih) imaju svoje vlastite pojedinačne gene nizvodno od gena replikaze.

Nsps uključuje stvari poput enzima (reaktora posrednika / ubrzavanja) koji pomažu kopiranju RNK i obradi polipeptida, koje je potrebno usitniti u njihove pojedinačne proteine. Unutar poliproteina nalaze se 2 proteaze, s različitim specifičnostima sekvenci, koje režu poliproteine u njihove pojedinačne nsps. Papainova proteaza (PLpro) kodirana je unutar nsp3, a serpna „glavna proteaza“ (Mpro) je kodirana nsp5. PLpro je odgovoran za prvih nekoliko rezova (odvajanje nsp1 / 2, 2/3 i 3/4), a Mpro rukuje s ostatkom.

Budući da virusima trebaju proteaze da bi napravili funkcionalne proteine iz poliproteina, neki antivirali su inhibitori proteaza – uključujući i kombinirani lopinavir / ritonavir za liječenje HIV-a (zaštitni znak Kaletra). Znanstvenici su se nadali da će Kaletra također pomoći u liječenju covid19, ali rezultati malog pokusa otkrili su da to nije djelotvorno i uzrokuje nuspojave.

To je bila razočaravajuća vijest. Ali to nije iznenađujuće jer su virusne proteaze specifične i različite jedna od druge. Tako znanstvenici rade na dizajniranju inhibitora za glavne proteaze SARS-CoV-2, doslovno! Kao dio projekta “COVID Moonshot”, Diamond Light Source u Velikoj Britaniji prikupio je tisuće rentgenskih kristalografija “3D slike” Mpro-a vezanih za različite fragmente lijeka iz složene biblioteke. Ovi fragmenti su poput dijelova potencijalnih lijekova koji se mogu modificirati i / ili spojiti kako bi se napravili lijekovi pune veličine koristeći informacije o tome kako i gdje se vežu. Dizajn koji se temelji na fragmentima zahtijeva mnogo posla, pa su na javni poziv znanstvenici iz cijelog svijeta odgovorili , poslavši veliki broj potencijalnih lijekova. Više o ovome https://bit.ly/mproinhibitors

Bilo je govora o pokušaju inhibiranja ljudskih proteaza koje pomažu SARS-CoV-2 u njegovom staničnom unosu – uglavnom TMPRSS2, ali i katepsin i furin. Ove ljudske proteaze NE režu poliprotein virusa – virus sam to radi. Ali ove ljudske proteaze presjecaju SARS-CoV-2 Spike protein, dopuštajući mu dramatičnu promjenu oblika (konformacijska promjena) koja mu omogućuje da izbaci svoj unutarnji proteinski dio, zakači na membranu domaćina i privuče je uz na virusnu membranu da ih spoji.  Više https://bit.ly/coronavirusspike 

Ako se protein šiljka (Spike) ne izreže, ne može napraviti tu “gimnastiku”.  Tako inhibiranje tih proteaza može inhibirati virus. Ali trebaju nam i te proteaze! TMPRSS2 je manje potreban od ostalih (što je vjerovatno dio razloga zašto su neke vrste stanica osjetljivije na invaziju), pa bi ga bilo moguće ciljati više nego ciljati katepsin ili furin. Ali još uvijek bi bila puno bolja ideja ciljati nešto što virus treba, ali mi nemamo. Pa da štetimo samo virusu, a ne čovjeku.

Jedna vrsta tih “samo virus napadam” terapija je RNA zavisna RNA polimeraza (RdRP) inhibitori poput remdesivira, koji djeluje kao adenozinski analog (glumi RNA jedinicu A), da upropasti virusnu replikaciju (kopiranje gena).

Mala veličina SARS-Cov-2 čini kopiranje vremenski kraće, ali činjenica da je zapisano u RNA, a ne u DNK, znači da virus mora osigurati vlastiti ʺkopirni strojʺ, jer naše stanice nemaju RNA → RNA kopirni mehanizam ( RNA ovisna RNA polimeraza (RdRP)). Dakle, jedan od nsps (nsp12) je RdRP. Budući da nemamo nijednu od njih, nudi nam se kao privlačna meta.

Kad idete ciljati enzim i stvarno želite zabiti strelicu u srce, idite na to srce – “aktivno mjesto”, gdje se reakcijske molekule okupljaju i mijenjaju. Za RNA polimerazu, ovo aktivno mjesto je mjesto na kojem  RNA jedinice  dolaze kako bi se povezale. Dakle, ako želimo upropastiti stvari, možemo upotrijebiti nešto što nalikuje RNA-jedinicama (nukleotidni analog), ali modificirano na neki način da ili uništi enzim ili usisa proizvod.

Ali postoji problem kopirni mehanizam može biti različit, ali jedinice koja upotrebljavaju su iste – koristi iste jedinice (nukleotide) RNA koje koriste naše stanice, samo ih povezuje redoslijedom koji želi na temelju svog RNA predloška. Umjesto onoga što naše stanice rade pri pisanju RNA – povezivanje nukleotida u željenom redoslijedu temelji se na DNK predlošku (proces naziva transkripcija). Dakle, kada ciljamo RdRP, moramo biti sigurni da ciljamo samo RdRP, a ne vlastitu DNA ovisnu RNA polimerazu. Srećom, našu polimerazu nije tako lako zavarati pa ih lijek remdesivir ne miješa.

Ali kako se točno miješa s virusnom polimerazom? Laurel Oldach napisala je zaista sjajan članak za ASBMB o remdesiviru – i to je uistinu sjajan format – možete kliknuti na različite dijelove molekule da vidite kako različite „funkcionalne skupine“ daju lijeku različite kemijske „supersile“. http://bit.ly/2Wttg76 

Potičem vas da pogledate njezin članak kako biste saznali više, a o njemu sam napisala i post: https://bit.ly/remdesivirbiochemistry

Ali evo pregleda. RNA jedinice (ribonukleotidi) imaju 3 glavna dijela – šećer riboze povezan s fosfatnim skupinama (na položaju „5“) i 1 od 4 jedinstvene dušične baze na položaju 1 (A, U, C ili G). Na položaju 3 na ribozi je hidroksilna (OH) skupina. Nukleotidi se  povezuju 5 ‘do 3’ pomoću fosfatnih i hidroksilnih skupina.

Za razliku od nekih nukleotidnih analoga, koji djeluju kao terminator obaveznih lanaca (dodate jedan i gotovo je) jer nemaju 3 ‘hidroksilnu (OH) grupu potrebnu da se spoje na drugu jedinicu (nukleotid), remdesivir ima 3’OH , tako da se može dodati više grešaka prije nego što uzrokuje prekid lanca, jer potencijalno male razlike  oblika nukleotidne jedinice, mogu učiniti RNA manje pogodnom za polimerazu koja je drži. A 3 ‘OH može mu omogućiti da se provuče pored virusnih ʺlektoraʺ, tako da virus ne shvati da je zbrkao RNA i pokušao je popraviti.

Remdesivir je prolijek, što znači da ga naša tijela moraju malo izgladiti kako bi dobila aktivni oblik. Promjene koje trebaju biti učinjene za remdesivir uključuju dodavanje 5 ‘fosfat – nukleotida kao trifosfata, dakle tri fosfatne skupine u nizu (od kojih se dvije utroše za plaćanje troškova energije povezivanja), ali Remdesivir ima samo jednu – i to je “skrivena zaštitnom skupinom. Unutar naših tijela ta se skupina odvaja, a druga dva fosfata dodana su enzimima koje naše stanice već imaju – tako da aktiviranje izgleda kao “ne tako velika stvar”. Ali može li remdesivir biti velika stvar?

Podaci ranih kliničkih ispitivanja pokazuju da to možda nije mnogo, ali nekim pacijentima donosi neku malu korist. U ispitivanju od 1.063 pacijenta (jedan od onih dvostruko slijepih zlatnih standarda, randomiziranih, placebo kontroliranih), remdesivir je skratio prosječno vrijeme hospitalizacije s 15 na 11 dana. I malo je smanjila stopu smrtnosti, s 11,9% za placebo do 7,1% u tretiranoj grupi, ali to nije bilo dovoljno za postizanje statističke važnosti .  https://bit.ly/3c7v6i7 

Daljnja ispitivanja su još u tijeku, ali rezultati ove studije financirane od NIH-a, objavljene u časopisu New England Journal of Medicine, https://bit.ly/2X6Axd4 , vodio je FDA da izda odobrenje za hitnu uporabu (EUA), što znači da ga liječnici mogu dati hospitaliziranim pacijentima izvan kliničkih ispitivanjahttps://bit.ly/2M567BB

FDA je također nedavno ukinuo EUA koji je izdao za drugi lijek koji je imao puno hipoteza ,a  nedovoljno značajnih podataka – klorokin ili njegov stabilniji oblik, hidroksiklorokin. To je antimalarični lijek koji postoji već više od pola stoljeća.

Malarija je parazitska bolest, nije virus, ali klorokvin ima i određeno antivirusno djelovanje. Smatra se da sprječava da virus uđe u stanicu i / ili izađe nje tako što se miješa s njegovim načinom prenosa – kada virus uđe u stanicu, ponekad čini  tako što se u ćeliju nekako utisne u dijelu membrane za koji se virus vezao (pomoću proteinskog šiljka pribijenog za receptor na staničnoj površini).

Kada virus dođe u ćeliju, još uvijek je zatvoren unutar vrećice povezane s membranom koja se zove endosom. Klorokvin remeti pH u endosomima, za šta se teoretiziralo da bi mogao spriječiti izlazak virusa (a radi i neke druge stvari).

U ranoj fazi pandemije, rezultati su objavljeni uz VRLO male „otvorene“ studije (pacijenti i liječnici znali su koji pacijenti se liječe čime) koji pokazuju početne obećavajuće rezultate, uključujući kada je klorokvin kombiniran s antibiotikom azitromicinom (što bi moglo biti pomoć u borbi protiv sekundarnih bakterijskih infekcija koje se mogu razviti nakon što pacijentova pluća postanu ranjiva virusom) Ali studija je zaista bila loše postavljena, više je bolesnika odustalo i imali su zaista nizak prag uspjeha. Sjajan članak od Jason Pouge na ovu temu možete naći ovde https://twitter.com/jpogue1/status/1241138975802359813?s=20

Daljnja ispitivanja (uključujući dobro dizajnirana) nisu pronašla nikakve koristi – a ti lijekovi mogu imati ozbiljne nuspojave, tako da NIJE situacija „nema se što izgubiti“. Potičem vas da pogledate ovaj znanstveni članak Dereka Lowea koji donosi rezultate dosadašnjih studija o svim tim lijekovima http://bit.ly/3ddpyVg  Čini se da hipoteza o hidroksiklorokinu napokon nestaje.

Ne možemo kriviti ljude jer su se nadali. I zato što su želili neko brzo rješenje. Ali surova realnost je takva da je razvijanje terapije dugotrajan proces. Razlog zbog kojeg su ovi lijekovi bili dopušteni da se pokrenu ispitivanja je taj što su već bili odobreni ili barem bili blizu odobrenja za druge svrhe. Tako su otkrili da su „sigurni“ (barem dovoljno sigurni da se mogu koristiti u usporedbi s njihovim benefitima za određeno stanje), oni su bili uredni za ponovnu upotrebu – ponekad kroz iznimke „suosjećajne uporabe“, a ponekad kroz službena klinička ispitivanja. Ova službena ispitivanja važna su kako bi se znalo da li lijek ima nepredviđene nuspojave specifične za ovo novo stanje u kojem se koristi, te stoga nisu bili problem prilikom testiranja za upotrebu u druge svrhe. Uz to, kontrolirana ispitivanja su presudna za otkrivanje je li lijek doista učinkovitiji od postojećeg standarda liječenja ili se pacijenti s njim osjećaju bolje jer bi ionako bili bolje.

Kada govorimo o pacijentima koji su bili bolje – „biti bolje“ uključuje adaptivni imunološki odgovor u kojem bolesnikov imunološki sustav uči prepoznati dijelove virusa kao strane (obično dijelove šiljaste -spike proteine u slučaju ove vrste virusa) zbog razvijanja malih proteina nazvanih antitijela koja se specifično vežu na taj protein i daju imuni odgovor.

Čak i nakon uklanjanja infekcije, niska razina tih antitijela se zadržava kako bi se “držalo na oku” – to je razlog zašto se testovima antitijela može otkriti je li netko imao virus u prošlosti i oporavio se. I zato istraživači daju krvnu plazmu (krv bez krvnih stanica) koju su trenutno oboljeli pacijenti darovali oporavljenim pacijentima. Ovaj se tretman naziva “rekonvalescentna plazma” (CP) terapija. To daje obećanje, ali također nisu naročito mjerljiva , te  vrlo su varijabilna. Pored antitijela protiv SARS-CoV-2, plazma sadrži antitijela protiv gomile drugih stvari s kojima se donator susreo. Čak se i antititela na SARS-CoV-2 razlikuju od donora do donora jer je razvijanje antitijela kao odgovor na infekciju nastalo slučajnim procesom pokušaja i pogreške miješanja i podudaranja različitih dijelova antitijela da bi se vidjelo što konkretno veže virus . Imuni sistemi kod različitih ljudi pronalaze različita rješenja.

Znanstvenici se nadaju da mogu izolirati neka od najboljih antitijela iz krvi pacijenata koji su se oporavili od covid19, masovno ih proizvesti i koristiti ih za liječenje i / ili cijepljenje pacijenata protiv covid19 stavljanjem njihovog imunološkog sustava pod nadzor i / ili blokirajući virusu pristup do ćelija. Antitijela koja mogu učiniti blokiranje virusa nazivaju se neutralizirajućim antitijelima (NAbs) i ona obično vežu Spike protein, često na način koji sprečava da se Spike protein veže na stanični ACE2 receptor i zarazi stanicu.

Kada govorimo o sprečavanju, osim liječenja pacijenata koji su već bolesni, tretmani antiijelama čak bi mogli spriječiti da ljudi dobiju bolest u prvom redu ako bi se uzimali kao profilaktička sredstva. Ali ovi tretmani koji se temelje na antitijelima zahtijevaju mnogo vremena i skuplji su od stvaranja lijekova s malim molekulama poput remdesivira. Možemo sintetizirati remdesivir kombinujući razne kemikalije pod odgovarajućim uslovima. Ali “sintetiziranje” antitijela znači stvaranje – i pročišćavanje – čitavog proteina – i mnogo više od toga. Dakle, ne očekujte da će svi tek početi uzimati preventivna antitijela – ali ljudi visokog rizika mogu imati koristi . (npr.nečiji partner oboli od COVID-19, onda se mogu koristiti antitijela da i onaj drugi ne bi dobio).

Ali to je još uvijek daleko. Svaki novi lijek morat će proći studije o sigurnosti i djelotvornosti, što može biti dugotrajan proces, ali zaista je važno da se pravilno napravi.  U međuvremenu, mnoge tvrtke ionako štite svoje oklade i ionako proizvode puno lijekova tako da će, ako dođe do odobrenja, biti spremne pružiti ih. Hoće li se osigurati po razumnoj cijeni – i zemljama u razvoju – to je sasvim druga priča.

Dakle, suština – lijekovi  su u procesu izrade i testiranja – uključujući neke koje nisam spomenula, poput famotidina (pepcid), u čijoj izradi sudjeluju nekoliko doktora iz CSHL-a i čini se da bi moglo biti od koristi na nekim podacima o promatranju, ali nitko zapravo ne zna zašto … Trenutno je u tijeku pravo kliničko ispitivanje u New Yorku, pa budite u toku i čini se da su od pomoći prema nekim opservacijskim podacima, ali niko ne zna zbog čega… Trenutno je u tijeku pravo kliničko ispitivanje u New York-u, pa budite u toku. https://bit.ly/37wQJYy

Jedna teorija kaže da famotidin ima modulaciju imunološkog odgovora pacijenta kako bi se spriječila vrsta “prekomjerne imunološke reakcije” zvane citokinska oluja koja može dovesti do nekih od najozbiljnijih problema. I drugi poznati imunološki modulatori također su u ispitivanjima, uključujući steroide poput Dexamethasone-a za koje je utvrđeno da smanjuju smrtnost kod teško bolesnih pacijenata (ali NE u blagim slučajevima, tako da ne biste trebali pokušavati kupiti). https://bbc.in/3fHCmUr

Ali modulatori imunološkog sustava su veliki trik 1) sam imunološki sistem je trik 2) postoji tanka linija između nedovoljnog reagiranja i pretjeranog reagiranja. Dakle, liječnici moraju znati kada trebaju pojačati odgovor i kada ga trebaju smanjiti. A onda propisati stvari u skladu s tim. A da bismo to znali potrebno nam je više istraživanja. Ovo istraživanje uključuje klinička ispitivanja, kao i pokušaj da se utvrdi postoje li određeni “biomarkeri”, poput povišene razine različitih signalnih molekula u krvi kod pacijenata koji imaju veću vjerojatnost da će reagirati na različita liječenja.

Jedna od nada je da će ljudi nastaviti prakticirati socijalnu distancu, osim što ćemo spriječiti širenje slučajeva da ne preopterete zdravstveni sistem, kupit ćemo vrijeme naučnicima kako bi pronašli efikasnu terapiju. Pa ako ste konačno izašli iz “shutdown“a  poput mene, uživajte,ali odgovorno!

more on topics mentioned (& others) #365DaysOfScience All (with topics listed) 👉 http://bit.ly/2OllAB0

Many thanks to Andrej Doko for this translation! Andrej is originally from Sarajevo,Bosnia and Herzegovina and is currently a student of clinical laboratory science at University Apeiron in Banja Luka,Bosnia.

Leave a Reply

Your email address will not be published.