Coronavirus test,test koji ljudi zapravo žele uzeti! Ali koji je test najbolji? To nije jednostavan odgovor! Tradicionalno coronavirus test koristi molekularno biološku tehniku zvanu RT-PCR da stvori mnogo kopija genetičkog materijala specifičnog za SARS-Cov 2 (novi coronavirus koji uzrokuje bolest zvanu Covid 19) i koristi fluoroscentne probe da otkriju da li stvorene kopije upućuju na prisustvo virusa. Serološki testovi na antitijela koriste tehniku zvanu ELISA da pronađu male proteine zvane antitijela koja naš imuni sistem stvara na specifični virus. PCR testovi traže sami virus, imaju ograničenu mogućnost prepoznavanja tokom infekcije, ali otkriju viruse u ranoj fazi infekcije. Međutim testovi antitijela traže dokaz za specifična antitijela na virus. Oni ne mogu detektovati virus u ranoj fazi, prije imunog odgovora, ali mogu detektovati virus u kasnoj fazi (možda 3-4 dana od pojave simptoma) sa jako brzim i jednostavnim testom. I možda i bitnije, oni su u stanju ukazati kada je neko već imao virus i oporavio se jer neka antitijela organizam koristi u borbi protiv infekcije, tako što i dalje („stražare“), nakon infekcije. Razvijena antitijela su dio adaptivnog imunog odgovora, i ovo je vrsta pokušaj i greška procesa gdje tijelo eksperimentira sa mješanjem i konstantnim spajanjem varijabilnih proteina antitijela, kako bi pronašlo jedno koje će vezati djelić virusa. (antitijela često ciljaju proteinske šiljke koji strše iz virusne membrane i omogućuju ulazak u našu ćeliju). Vaše tijelo tada koristi ta antitijela u pozivu „pomoćnika“, da unište virus kada god se antitijelo „zalijepi za virus“.  Dok je pacijent inficiran mnoga antitijela se stvore i aktivno rade boreći se protiv virusa. Ali jednom kad infekcija prođe antitijela i dalje stražare. Ovaj put ako se virus vrati da ponovo inficira, ona omogućavaju imunitet protiv reinfekcije, što bi značilo da oporavljeni pacijent može slobodno da izlazi među ljude, isto je važno za zdravstvene radnike da mogu raditi s pacijentom sa manjim rizikom. Ali važna stvar je da će komercijalni testovi vjerovatno biti po principu da/ne, odnosno ukazivat će da li je antitijelo tu ili nije, ali ne znaju koliko antitijela ima i koliko je imuni sistem spreman da napadne. Kako kaže moja prijateljica, Dr Samantha Le Sommer (hvala još jednom), „ogromna je pretpostavka sa ovim testovima da  izlaganje znači imunitet“. Postoje načini da mjerimo „razine“ antitijela, ali o tome nešto kasnije. Dodatno, znajući da je neko prebolio je vrlo korisna informacija za epidemiologa. Npr. u ranoj pandemiji kad se pojavi nekoliko slučajeva obično je jednostavno za traženje slučajeva počevši od poznatog koji već ima bolest, da se otkrije odakle je dobio (lanac prenosa), radeći na tome da se otkriju ljudi koji su bili u kontaktu sa zaraženim staviti ih u karantenu i pratiti da li se razvija bolest. Ali pošto neki ljudi nose virus bez simptoma, postoje slučajevi koje doktor ne može otkriti metodom direktne linije prenosa, pa testovi na antitijela rješavaju zagonetku, kao što je po prvi put pokazao tim iz Singapura https://bit.ly/2URzxqO.

Strategija se još uvijek koristi u regijama koje još nisu ozbiljno pogođene, da se presječe prenošenje od izvora. Čak i u regijama gdje se proširilo „prenosom u zajednici“ gdje nema stvarne nade da se otkrije tačan uzorak širenja, pronalaženjem ko se inficirao, pomaže doktorima i naučnicima,da otkriju više o širenju bolesti i zašto su organizmi nekih ljudi nepodložni njemu. (što može dati potencijalnu ideju o strategiji liječenja bolesti). Trenutno nemamo dovoljno testova da testiramo sve, tako da ne znamo precizno proširenje bolesti. Ovo je dobar dio razloga zašto možda vidimo različitu statistiku o Covidu kada dođe do velikih varijacija u prijavljenim smrtnim slučajevima, broju inficiranih itd. Kao rezultat čak sada da i imamo testove napravljene za cijelu državu ne bismo imali ni približno dovoljno za sve zahtjeve. Zbog toga,samo ozbiljni slučajevi ili ljudi koji su izloženi na prvoj liniji su u mogućnosti da se testiraju, a ostalima se preporuči samoizolacija ako imamo virus a da ne znamo da ga imamo. Ovo sigurno djeluje vrlo  anksiozno za pacijenta ali i za radnike javnog zdravstva  nastojeći da otkriju gdje i koliko se proširio virus i kako se izboriti. Dok se svi ovi pacijenti oporave testirani ili netestirani,mnogo slučajeva ostaje neotkriveno, ali nije kasno da ih detektujemo samo trebamo druge testove. Trenutni test koji sekoristi je RT PCR. Više o njemu ovde:  : https://bit.ly/covid19bbresources 

Treba im vremena jer potrebno je prije svega izolirati virusnu RNA (RNA ekstrakcija),što je „delikatna“ procedura koja se radi u laboratoriju. Skoro, Abbot je napravio novi brzi test zvani ID NOW. To je primjer „point of care“ testa, što znači da ga doktor može uraditi odmah u ordinaciji, bez prethodnog nošenja u laboratorij. Sličan je tradicionalnom PCR testiranju traži djeliće virusnog gena, ali kopira ih koristeći druge tehnike zvane izotermalna amplifikacija. Ne zahtjeva ekstrakciju RNA umjesto toga sam otvori ćeliju u mašini i uradi sve jako brzo ( 10-15 minuta). Sličan test se koristi i za detekciju drugih virusa poput gripe i upale grla, ali još ne znamo koliko je osjetljiv i precizan verzija za Covid-19 u poređenju sa PCR testom.  Oba traže virusnu genetsku informaciju (koja je tu samo ako je i virus prisutan,ali to je uglavnom u ranoj fazi infekcije) i tipično se koriste uzorci, prikupljeni bris iz nosa ili grla. Test antitijela traži antitijela protiv virusa, koja se samo prikazuju u kasnoj infekciji (tim naučnika u Mount Sinai bolnici u New York razvio je test koji ukazuje na antitijela čak tri dana nakon pojave simptoma). https://wb.md/2JwBDac 

I ovi testovi traže antitijela u uzorcima krvi. Ako bi uzeli  krv i centrifugrali je u epruveti sa antikoagulansom da spreči zgrušavanje. Krvne ćelije će se prihvatiti za dno epruvete, a ostatak krvi (krvna plazma) će ostati gore. To je većinom voda, ali takođe sadrži sekretovana antitijela i proteine, zvane faktori zgrušavanja, koji omogućavaju zgrušavanje krvi. Ako bi uzeli  krv i prije toga je centrifigirali i dopustili da dođe do zgrušavanja, tečnost koja ostane nakon toga zove se serum. Serum je plazma bez faktora koagulacije (zgrušavanja) . Serum i plazma mogu se koristiti za ELISA test, ako je antitijela moguće otkriti u krvi kažemo da je pacijent „serokonvertan“- tako npr. prema Mt. Sinai paper, „serokonvertan“ je pacijent nakon tri dana poslije pojave simptoma.

Kako znati je li pacijent serokonvertan? Tipični serološki test zvani ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), koji  traži virusna specifična antitijela na ploči i onda daje signal ako su prisutna.

Testovi se obično izvode u bunarčićima mikrolitarske ploče. Ovi bunarčići su ispunjeni virusnim proteinima da djeluju kao antigen (stvar koju veže antitijelo). Neki antigeni koji se testiraju dio su nukleokapsidnog proteina,koji  okružuju i štite virusnu RNA (i to su najbrojniji virusni proteini), i šiljasti proteini koji izbijaju iz virusne membrane i vežu se za receptore na ćeliji domaćina. Ovo se može izvesti rekombiniranjem- naučnici zalijepe pojedinačno gene da vrše ekspresiju praveći ćeliju u laboratorijskim uslovima bez rada sa pravim virusom.

Kada razviju test, naučnici moraju biti sigurni da je pronađeni antigen jedinstven virusu, tako npr. možete koristiti nešto iz SARS-Cov2- (novog koronavirusa) što je dovoljno jasno iz orginalnog SARS-Cov virusa, tako da ako pacijent ima antitijela na SARS-Cov, neće biti lažno pozitivan zbog reakcije ukrštavanja. Ali naučnici moraju osigurati da antigen koji koriste je sposoban detektovati antitijela koje pacijent ima ( dakle, potrebna je preciznost i osjetljivost).

Za fazu razvoja potrebno je malo vremena do optimizacije, ali cijeli proces testiranja može biti automatizovan i ne traje toliko dugo.

Prvi korak je dodavanje uzorka-plazma ili serum koji se zagrije prvo da ubije bilo koji živi virus,čineći ga sigurnijim za onog ko vrši testiranje. Ako uzorak sadrži antitijela, koja mogu specifično vezati virusni protein, ona će se vezati. Ako pak nisu, ispere se u slijedećem koraku, kada se peru bunarčići nekoliko puta da se ispere sve što je ostalo nevezano.

U ovom trenutku ne možete tvrditi ako se samo nešto vezalo, trebate neki način da detektujete primarna antitijela koja su vezana. Ovo se radi dodavanjem sekundarnih antitijela koja prepoznaju generički „prilagodljivi“ dio  primarnog antitijela (konstantnog regiona). Npr. Mt. Sinai grupa koristila je anti humani IgG kao sekundarno antitijelo (postoje nekoliko različitih „prilagodljivih dijelova koja se mogu koristiti da bi dala različite izotope antitijela i IgG je jedan od tih). Ponekad , „oznake“ sekunarnih antitijela  su direktno vidljiva, ali nekad drugo, moramo dodati vidljivu „oznaku“. Npr često, sekundarna antitijela su označena HRP-om (horse radish peroxidase). Prvo se još uvijek ne vide, ali kad oda isperemo i dodamo drugu hemikaliju zvanu OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) HRP prevodi OPD u žućkasto-narandžasto obojeni produkt (2,3diaminophenazine) čija se obojenost može mjeriti korištenjem UV-Vis spektroskopije.

Vratimo se na ono „koliko antitijela ima“ pitanje, kako bi odgonetnuli pacijentov uzorak se serijski razrijedi „ (e.g 1:10, 1:100,1:1000), da možemo vidjeti koliko se antitijela može razrijediti,a da  se i dalje dobije pozitivan rezultat i uzme se obrnuta proporcija da se odredi titar antitijela, koliko je antitijela  sadržano u uzorku. Ovo može biti vrlo korisno ako neka trenutno zdrava osoba ima visok nivo antitijela protiv SARS Cov-2, može biti u mogućnosti da donira krv pacijentima kojim je potrebna.


Huge thanks to Andrej Doko, an undergraduate student of clinical biochemistry (medical laboratory science/diagnostic) at Bosnia’s University of Health Science “Apeiron” Banja Luka, for the translation!

Leave a Reply

Your email address will not be published.