Eu sei que têm ouvido BASTANTE sobre a COVID-19 (a doença causada pelo novo coronavirus SARS-CoV-2, também conhecido como 2019-nCOV). Eu tenho evitado escrever sobre o tema porque não queria apenas adicionar à inundação de informação que pode parecer muito esmagadora, e eu sei que todos nós necessitamos de um pouco de ar de vez em quando. Estou muito agradecida aos investigadores de saúde pública e à sua partilha de informações, mas este não vai ser mais um texto a dizer-vos para lavarem as mãos (o que devem fazer) – em vez disso, eu quero partilhar convosco como é que o teste de diagnóstico funciona. Não vou entrar em detalhes políticos – e não vou fazer nenhumas previsões – portanto, por favor, não me perguntem sobre isso. Mas pensei que uma área relativamente pouco explorada, na qual eu poderei ser capaz de ajudar a explicar, é a ciência por detrás de como os testes realmente funcionam.

A maior parte dos testes, incluindo os testes do CDC oficiais dos Estados Unidos, utiliza o que é chamado de Reação em Cadeia da Polimerase com Transcriptase Reversa (Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR, em inglês) para detetar informação genética do SARS-CoV-2. O SARS-CoV-2 é um vírus de ARN – em vez de armazenar a sua informação genética (genoma) em ADN, como nós, ele armazena-a na forma de ARN. Na forma de cadeias simples.

Neste ARN encontram-se instruções para produzir proteínas que o vírus necessita. Um vírus apenas “se importa” com uma coisa – reproduzir mais copias de si mesmo e infetar mais células. Desta forma, os genes que encontramos no seu ARN refletem o que é necessário para que tal aconteça. Alguns exemplos:

  • Este tem que produzir cópias do seu ARN, portanto necessita de uma polimerase de ARN dependente de ARN (RdRP) que possa percorrer a cadeia simples de ARN e a utilize como modelo para produzir uma cadeia complementar de ARN – que pode posteriormente ser utilizada para produzir uma copia da cadeia simples original, que pode depois ser utilizada para produzir uma copia da cadeia complementar, que depois… penso que se entende o processo – graças à natureza do ARN e do ADN, em que cadeias complementares formam pares de bases (a letra A emparelha com a U (ou T no ADN) e a G com a C), estes podem ser copiados. E, como o vírus codifica para uma polimerase de ARN dependente de ARNA, este é capaz de copiar o seu próprio genoma.
  • Depois este tem de revestir essas cópias de ARN numa ”concha” composta por proteínas, chamada de nucleocápside, importante para sua proteção durante a sua jornada. Portanto este necessita de um gene que codifique a proteína da nucleocápside (este é chamado de gene N e é o que os testes do CDC procuram)
  • De seguida, este tem de ser capaz de sair das células onde se encontra para que possa encontrar e infetar uma nova célula, onde poderá repetir todo o processo. Para isto, este necessita de uma proteína que se encontra no seu envelope (o teste da OMS procura por este ”gene E” que codifica a proteína do envelope).
  • Mas, antes de conseguir entrar numa nova célula, o vírus necessita de se ”colar” à sua superfície e consegue-o utilizando proteínas Spike (S) que se projetam do envelope como uma coroa (daí o nome corona) e se ligam a recetores na superfície da célula que se tornará o seu novo hospedeiro.

Os seres humanos não necessitam destas coisas para nós mesmos, portanto nós não temos instruções para estes passos no nosso genoma. Assim, se os cientistas encontrarem estes ARNs numa pessoa, isso indica que essa pessoa tem um vírus.

Mas como é que vamos encontrar esse ARN? Existe uma série de desafios, dos quais o primeiro é que, mesmo que existem muitas cópias do vírus, a quantidade total de ARN é mesmo assim muito pequenina. E, para piorar as coisas, moléculas de ARN são bastante instáveis – por isso, durante o seu isolamento (extração de ARN) perdemos sempre um parte do ARN como que iniciamos o processo.

Por isso, são necessários métodos bastante sensíveis para detetá-lo entre todos os outros ARN e ADN (coletivamente chamados de ”ácidos nucleicos”) presentes. Uma maneira de o fazer é amplificando o sinal sem alterar o”ruído” – fazer muitas cópias específicas da informação genética viral que está presente.

Felizmente, os cientistas sabem há já cerca de meio século como levar uma Polimerase de ADN a produzir muitas cópias de fragmentos de ADN especifico in vitro (num tubo) usando um método chamado Reação em Cadeia da Polimerase (em inglês, Polymerase Chain Reaction, PCR). Os fragmentos a serem copiados (amplicões) são especificados por pequenos pedaços de ADN chamadas “primers” que são desenhados para se ligarem onde se quiser que as cópias comecem e acabem (um primer por cadeia). O PCR é feito numa série de ciclos onde ocorre o EMPARELHAMENTO (annealing) – ligação dos primers -> ENLOGAMENTO (elongation) – a polimerase sintetiza o fragmento de ADN entre os primers para produzir uma molécula de ADN de cadeia dupla -> DESNATURAÇÃO (melting) – aumento da temperatura para que as cadeias se separem e seja possível repetir tudo de novo.

Mas as polimerases que são utilizadas são polimerases de ADN dependentes de ADN – uma frase complicada que apenas significa que estas produzem cópias de ADN a partir de moléculas de ADN, o que leva ao desafio número 2: o SARS-CoV-2 é um vírus de ARN?!

Felizmente, temos uma solução para isso também, que é onde a componente “RT” em “RT-PCR” entra em jogo. RT significa Reverse Transcription em inglês (Transcrição Reversa em português), e é o processo pelo qual se produz uma copia de ADN a partir de um modelo de ARN. Chama-se transcrição reversa porque o processo pelo qual se produz ARN a partir de ADN se chama transcrição, que é o que as nossas células fazem para produzir cópias ARN a partir dos nosso genes de ADN, sendo depois utilizadas como instruções para fazer proteínas.

Por isso, antes do PCR, podemos utilizar a enzima “Transcriptase Reversa” para produzir cópias de ADN complementares do ARN viral, e assim ter ADN que a ADN polimerase irá facilmente copiar se fornecermos os primers corretos.

Mas ainda é necessária uma forma de detectar as copias que vão sendo produzidas. Isto é realizado utilizando sondas fluorescentes que, sendo pequenos fragmentos de ADN que emparelham especificamente com a região na qual estamos interessados, são um pouco como os primers. Mas, em vez de se emparelharem nas extremidades, eles ligam algures no meio da região a ser copiada e permitem-nos verificar que a copia está a ser produzida. A forma como isto funciona é fantastica, por isso se continuares por aqui, irei dar alguns detalhes..

A combinação primer/sonda permite procurar por esses pequenos trechos de letras no genoma viral que este vírus tem mas nós não (tais como partes dos genes N, E, ou RdRP). Mas, para encontrar esses pequenos trechos no ARN viral, precisamos primeiro de o encontrar. Onde é que o vamos procurar? Os testes são normalmente feitos em esfregaços do nariz ou garganta (oficialmente designados como amostras nasofaringicos (NP) ou orofaringicos (OP), respetivamente). Também pode ser pedido que a pessoa tussa alguma expetoração para se recolher uma amostra respiratória profunda também.

Com todas as noticias a informar sobre a COVID-19, é fácil esquecer que o influenza (gripe) e a constipação comum do dia-a-dia ainda estão em fúria. E parte do motivo pelo qual existe um enorme benefício à saúde publica em se espalhar ou mesmo atrasar o numero de infeções por COVID-19 é que as instituições de saúde ainda estão cheias de pacientes com gripe e não têm capacidade para acolher uma quantidade enorme de pessoas a necessitar de ventiladores e outros equipamentos (e médicos, enfermeiros, camas, etc.). Por isso, eu aconselho vivamente que espreitem a iniciativa “achatar a curva” (“flatten the curve”). Podem encontrar mais informações aqui: https://www.npr.org/sections/health-shots/2020/03/13/815502262/flattening-a-pandemics-curve-why-staying-home-now-can-save-lives


Estou a falar destas, ainda mais prováveis, causas da tua dor de garganta e da tua tosse porque é importante descartá-las e, mesmo que não seja a COVID-19, tu (e epidemiologistas) queres na mesma saber o que está a fazer-te doente. Por isso, os médicos frequentemente testam-nos primeiro e/ou também para o SARS-CoV-2, o que se pode fazer se também se incluírem combinações de primers/sondas direcionados a esses outros vírus e/ou se se adicionarem outros testes. Por exemplo, deves ter ouvido falar do teste “BioFire” – este é um teste baseado num chip que pode basicamente fazer muitas reações de PCR em diferentes poços num único chip, e portanto pode testar uma grande variedade de doenças respiratórias comuns de uma só vez – as 21 doenças que testa ainda não inclui o SARS-CoV-2, mas a empresa que o produz, BioMérieuzx, está a trabalhar nisso.

Mas, por agora, foquemo-nos nos testes que de momento temos – os testes do CDC usam sondas “TaqMan”. Estas “dual-labeled hydrolysis probes” funcionam usando uma técnica chamada FRET. Não faças já um frete se não sabes o que significa – deixa-me explicar. FRET significa Transferência de Energia por Ressonância de Förster (Förster Resonance Energy Transfere em inglês) e é um fenómeno espetacular que nos permite dizer se 2 moléculas estão próximas uma da outra. Uma molécula, o “fluoróforo dador” é capaz de emitir luz, mas apenas se outra molécula, o “aceitador”, não estiver próxima.

E, nas sondas, estas *estão* próximas (pelo menos no início…). E por falar no início, mas num sentido diferente, o fluoróforo (um grupo químico chamado FAM (6-carboxifluoresceína) nas sondas do CDC) está no início da sonda (o que chamamos de término 5’) e o aceitador (BHQ (Black Hole Quencher) nas sondas do CDC) está na outra extremidade (o término 3’). As sondas têm apenas 20 letras de comprimento, por isso o aceitador está próximo o suficiente do fluoróforo para o impedir de brilhar (eles estão apenas uns poucos nm separados, o que é cerca de 100.000 vezes mais pequeno que a espessura de um cabelo).

A luz é uma forma de energia, e diferentes comprimentos de onda da luz têm diferentes energias. Se tivermos um fluoróforo e incidirmos luz com um comprimento de onda que o fluoróforo “gosta”, ele absorve-a e entra num “estado excitado” – mas é difícil ficar excitado por muito tempo, por isso relaxa e liberta essa energia na forma de luz, o que podemos detectar.

Mas luz não é a única forma pela qual energia pode ser transferida – outra maneira é através de FRET. Se o aceitador gosta da quantidade de energia que o fluoróforo normalmente liberta *e* ambos estão perto o suficiente, o extintor pode absorver a energia que o fluoróforo normalmente libertaria na forma de luz – ele “absorve” a fluorescência http://bit.ly/2m5hpfh

Mas para que a absorção aconteça, o fluoróforo e o aceitador têm de estar juntos. Quando se separam, o fluoróforo pode brilhar livremente.

E estes são separados quando o ADN ao qual estão ligados é copiado, porque a ADN polimerase utilizada para produzir a cópia, a Taq polimerase, tem atividade 5’ nuclease. Por isso, se for copiar algum ADN e há uma sonda no caminho, a Taq “mastiga-a” quando a encontra – isto permite que a Taq remova a sonda e continue a copiar ADN – e separa o fluoróforo do aceitador, permitindo-nos ver a luz.

E esta luz funciona como um sinal de que uma cópia foi produzida, já que a Taq consegue “apenas” encontrar a sonda se ela estiver a copiar o ADN ao qual a sonda se ligou (quer dizer, teoricamente estes poderiam encontrar-se em qualquer lado mas isso é muito improvável a não ser que sejam forçados a encontrar-se pelo processo de cópia). E o facto de que uma cópia foi feita significa que a sequência alvo (como o gene viral) estava presente para ser copiada, indicando infecção.

Mas, como existem poucas cópias no inicio, a quantidade de fluorescência que se vê originalmente é muito baixa – indistinguível do “ruído de fundo” – por isso é necessário amplificá-lo.

Entre cada ciclo de cópias, temos outro passo de desnaturação onde as cadeias de ADN são separadas, e isto permite que sondas não degradadas (ligadas ao aceitador) se liguem durante o passo de emparelhamento (annealling) (os primers também se ligam a estas). Posteriormente, quando se entra na fase de enlogamento, onde o ADN é copiado, a Taq encontra e mastiga mais sondas. Assim mais sondas são “restauradas” é possível ver mais fluorescência.

Como cada cadeia é utilizada para fazer 1 cópia em cada ciclo, vamos de 2 -> 4 -> 8 -> 16 -> 32, etc. (crescimento exponencial) por isso vemos um crescimento exponencial na fluorescência até que algo acaba (sondas, primers, núcleotidos, etc.). Com quanto mais cópias começarmos, o mais rápido a fluorescência irá aumentar, por isso podemos determinar um limite de fluorescência de “referência” e depois ver “quão rápido” diferentes combinações de amostra/primers/sondas alcançam essa referência. Por “quão rápido”, normalmente falamos em termos de número de ciclos de amplificação.

Se fizermos um gráfico do número de ciclos vs. a fluorescência, obtemos uma curva com a forma de um guarda-chuva de lado, que não é um bom símbolo, mas mais ou menos (observe a imagem…).

O que procuramos é um valor denominado por valor Ct, que é o número de ciclos que são necessários para passar a “linha limite” que corresponde ao nível de fluorescência de fundo (ruído) – quando passamos o limite, significa que estamos acima do ruído de fundo – por isso sabemos que temos um sinal real e não apenas ruído. É difícil saber nos primeiros ciclos porque ainda temos muito pouco ADN a ser copiado, mas quanto mais cópias estão na nossa “pequena quantidade” inicial, mais cedo (menos ciclos) iremos passar o limite.

Por isso, RT-PCR é geralmente utilizado para verificar quantas cópias estão originalmente presentes (não um “sim/não” mas antes um “quanto”). Mas com estes testes, o número de cópias originalmente presentes não diz muito porque depende de coisas como quanto ARN estava presente na amostra e se algum foi degradado, etc. Em vez disso, necessitamos uma resposta sim/não, por isso um limite é identificado e se uma combinação amostra/alvo atingir valores acima do limite, esse alvo é positivo – mas considerar esse teste positivo no geral depende de como outros alvos responderam.

Os testes normalmente procuram pelo menos 2 partes de genes específicos do SARS-CoV-2 para poderem ter mesmo a certeza dos resultados. Se ambos forem amplificados, o teste é positivo; se apenas um for amplificado, o teste é inconclusivo; e se nenhum for amplificado, o teste é negativo (apesar de haver sempre a possibilidade de um “falso positivo”, especialmente se ambas as amostras foram degradadas – lembra-te de quão frágil é o ARN!).

Claro está que isto tudo é assumindo que o controlo negativo (uma amostra de ARN que não vem de SARS-CoV-2) deu negativo e o controlo positivo (uma amostra de ARN que sabemos que é de SARS-CoV-2) deu positivo – se isso não tiver acontecido, então algo está errado com o teste e os resultados são inválidos.

E isto pode ser um problema real, tal como os EUA descobriram da pior forma. RT-PCR é *mesmo* sensível – porque cada cópia de ARN original é amplificada exponencialmente. Por isso, uma contaminação muito pequena pode levar a que uma amostra negativa dê positivo (o chamado “falso positivo”). E isto pode ser o que pode ter acontecido com alguns dos primeiros kits de teste do CDC – algumas das combinações primers/sondas deram algumas vezes falsos positivos.

Até há pouco tempo, outros laboratórios foram restringidos de produzir os seus próprios testes para o vírus, por isso levou algum tempo até que testes pudessem ser realizados nos EUA, e há ainda uma grande necessidade para os aumentar. Alguns esforços têm sido feitos para semi-automatizar os processos para que mais testes possam ser realizados rapidamente – o protocolo do CDC usa placas de PCR com 96 poços (mais ou menos o tamanho de um iPhone grande, com os poços do tamanho de um furo de furador de papel) nos quais os cientistas têm de pipetar. Métodos automáticos ou semi-automáticos ajudam a acelerar o processo mas requerem equipamento mais caro.

Mas mesmo que a parte do PCR seja muito acelerada, a extração do ARN é ainda mais complicada. Um potencial limite é que a extração de ARN é tipicamente feita utilizando “kits” comercialmente disponíveis, como o DSP Viral RNA Mini kit. Os kits facilitam bastante, mas não são necessários – ARN era extraído já bastante antes da Qiagen começar a fazer kits para o efeito – e aqui está alguma informação sobre o método de extração de ARN de “velha escola”, que usa fenol-clorofórmio para isolar ARN de outras coisas baseado nas suas solubilidades relativas http://bit.ly/2Xj4Zyc

Os testes RT-PCR são apenas uma forma de testar o vírus – e apenas o detecta quando uma pessoa já está agudamente infectado, e o vírus ainda está a sintetizar todo o ARN que precisa para produzir todas as proteínas que necessita para sintetizar mais cópias de si mesmo e infectar mais células.

Assim que o vírus é “conquistado” pelo sistema imunitário da pessoa, esse ARN viral não está mais lá; contudo, evidências das proteínas produzidos a partir deste podem ser encontradas – a resposta imunitária que permitiu ao corpo lutar contra o vírus envolveu produzir pequenas proteínas chamadas anticorpos que reconhecem fragmentos especifico de proteínas virais como “estranhas” e desencadear a resposta imunitária.

Depois da infeção inicial, o corpo leva algum tempo a desenvolver anticorpos contra a mesma – o processo envolve as proteínas virais serem cortadas em pedaços e esses serem postos “em exposição”, mantidos por proteínas à superfície das células imunitárias. O corpo segue uma abordagem de “tentativa e erro” aleatória para fazer anticorpos que reconhecem (e ligam a) esses pedaços de proteína viral e depois produz mais dos anticorpos que conseguiram. Mais informação aqui: http://bit.ly/antibodytypesuses

Alguns desses anticorpos permanecem depois da infeção acabar de forma a “patrulhar” para que, se alguns dos mesmos vírus tentarem de novo, o sistema imunitário não precisa de entrar na fase de tentativa e erro para encontrar um anticorpo apropriado outra vez. Por isso, testes que procuram por anticorpos podem ver se alguém teve o vírus antes, mesmo depois de ter recuperado, e isto pode ser usado para rastrear casos de volta para analisar a linha de transmissão mesmo quando os transmissores não têm mais sintomas e não têm o ARN que os testes RT-PCR poderiam detectar.

Os testes de anticorpos são mais rápidos e são tipicamente realizados em amostras de sangue, mas uma desvantagem é que, já que estes são o resultado da resposta imunitária ganhar ao vírus, estes não conseguem detectar o vírus tão cedo na infecção, enquanto o RT-PCR sim.

As vacinas funcionam utilizando vírus não-infecciosos ou partículas virais para ativar o sistema imunitário e obrigar o corpo a utilizar o processo de tentativa e erro para gerar anticorpos que reconhecem o vírus e o incluem na “lista de procurados” sem que se tenha que ficar doente. Os cientistas estão a trabalhar para criar vacinas seguras e eficientes contra o SARS-CoV-2, mas vai levar algum tempo porque estas têm de ser desenvolvidas e testadas para a sua segurança e eficiência.

Espero que este texto ajude as pessoas a compreender o que se está a passar, e, por falar em ajuda, eu gostaria de ter a certeza de que estava a dar a informação mais precisa possível, por isso tive alguma ajuda de amigos que reviram o meu texto, e queria agradecer-lhes bastante. Obrigada Katie Meze, Dr. Alexandra Newton, Dr. Justin Kinney, Dr. Charles Murtaugh e Dr. Elisa Zhang.

E obrigada a todos a que estão a trabalhar para ajudar a achatar a curva! *Um dá cá mais cinco virtual*


Um grande obrigado à Joana Pereira por traduzir. A Joana é postdoc no Departamento de Evolução de Proteínas do Instituto Max Planck para Biologia do Desenvolvimento, e foi ajudada pela sua amiga Diana Freire na tradução para Português.


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