Ξέρω ότι ακούτε ΠΟΛΛΑ για τη λοίμωξη COVID-19 (την ασθένεια που προκαλείται από τον νέο κορονοϊό SARS-CoV-2 (γνωστός και ως 2019-nCoV). Μέχρι τώρα απέφευγα να ανεβάσω κάτι σχετικό γιατί δεν ήθελα να προσθέσω στον καταιγισμό πληροφοριών που μπορεί να γίνει υπερβολικός- ξέρω ότι όλοι μας μπορεί να χρειαζόμαστε μια μικρή ανάπαυλα. Είμαι ευγνώμων για τους ερευνητές δημόσιες υγείας και τις προσπάθειες ενημέρωσης που κάνουν, αλλά αυτή δεν είναι μία ακόμα δημοσίευση που σας υπενθυμίζει ότι πρέπει να πλένετε καλά τα χέρια σας (ΠΡΕΠΕΙ). Αντί γι’αυτό, θέλω να σας εξηγήσω με λίγα λόγια πώς δουλεύουν τα διαγνωστικά τεστ για την ασθένεια. Δεν θα ασχοληθώ με το κομμάτι της πολιτικής, ούτε θα κάνω προβλέψεις, οπότε μην με ρωτήσετε γι’αυτό. Σκέφτηκα όμως ότι η επιστήμη πίσω από το διαγνωστικό τεστ και το πώς δουλεύει είναι ένα κομμάτι που δεν έχει καλυφθεί αρκετά- και θα ήθελα να σας βοηθήσω να τα καταλάβετε!

Τα περισσότερα τεστ, συμπεριλαμβανομένου και του επίσημου τεστ που χρησιμοποιείται από τα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Ασθενειών στις Ηνωμένες Πολιτείες (Centers for Disease Control, CDC) χρησιμοποιούν αυτό που ονομάζουμε Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης με Αντίστροφη Μεταγραφή (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, ή RT-PCR εν συντομία), για να ανιχνεύσουν τη γενετική πληροφορία του ιού SARS-CoV-2. Ο SARS-CoV-2 είναι ένας ιός RNA- αντί να αποθηκεύει το γενετικό του αποτύπωμα (το γονιδίωμα του) σε DNA (δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ) όπως  εμείς, την αποθηκεύει σε RNA (ριβονουκλεϊκό οξύ). Αντί για μια αλυσίδα διπλής έλικας, όπως το δικό μας DNA, το γενετικό υλικό του ιού είναι μονόκλωνα μόρια RNA.

Μέσα σ’αυτό το RNA βρίσκονται οι πληροφορίες κατασκευής για τις πρωτεΐνες που χρειάζεται ο ιός. Ένας ιός «νοιάζεται» βασικά για ένα μόνο πράγμα: πώς θα φτιάξει αντίγραφα του εαυτού του και θα μολύνει περισσότερα κύτταρα του οργανισμού. Έτσι, οι γενετικές οδηγίες που βρίσκουμε στο RNA του παράγουν ακριβώς αυτά τα εργαλεία που χρειάζεται για αυτή τη λειτουργία. Μερικά παραδείγματα:

  • Πρέπει να φτιάξει αντίγραφα του RNA του, οπότε χρειάζεται μια RNA-εξαρτώμενη RNA  πολυμεράση (RNA-dependent RNA polymerase, RdRP) που μπορεί να ταξιδέψει κατά μήκος του RNA και να το χρησιμοποιήσει ως «καλούπι» για να φτιάξει μια συμπληρωματική αλυσίδα RNA- η οποία μπορεί στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί για να φτιάξει ένα αντίγραφο της αρχικής αλυσίδας, το οποίο μπορεί στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί για να φτιάξει ένα αντίγραφο της συμπληρωματικής αλυσίδας, το οποίο… το πιάσατε το νόημα. Χάριν στη συμπληρωματικότητα των βάσεων του RNA και του DNA (η βάση Α κάνει δεσμό με τη βάση U (ή Τ στο DNA) η βάση G με τη C) το γενετικό υλικό αντιγράφεται εύκολα. Και, αφού ο ιός κουβαλάει την πληροφορία για να φτιάξει τη δική του RNA πολυμεράση, έχει ό,τι χρειάζεται για να αντιγράψει το γενετικό του υλικό.
  • Στη συνέχεια πρέπει να κλείσει τα αντίγραφα του RNA του μέσα σε ένα «προστατευτικό κάλυμμα» από πρωτεΐνες, το πυρηνικό καψίδιο (nucleocapsid) ώστε να τα κρατήσει ασφαλή στο ταξίδι τους- χρειάζεται λοιπόν ένα γονίδιο που αποτελεί τις οδηγίες για την πρωτεΐνη του καψιδίου (αυτό ονομάζεται γονίδιο Ν και είναι το γονίδιο που «ψάχνουν» τα τεστ για τον ιό που χρησιμοποιεί το CDC).
  • Το επόμενο βήμα για τον ιό είναι να καταφέρει να «ξετρυπώσει» από τα κύτταρα που έχει ήδη καταλάβει για να βρει ένα νέο κύτταρο και να ξεκινήσει από την αρχή- γι’αυτό το σκοπό χρειάζεται ένα περίβλημα, που περιέχει μια πρωτεΐνη που φτιάχνεται με βάση το γονίδιο Ε (Τα τεστ του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας  «ψάχνουν» για αυτό το γονίδιο).
  • Πριν όμως ο ιός καταφέρει να εισβάλει σε ένα καινούριο κύτταρο, πρέπει να μπορέσει να «κολλήσει» στην επιφάνεια του κυττάρου- αυτό το καταφέρνει χρησιμοποιώντας τις «αγκαθωτές» πρωτεΐνες S (Spike) που προεξέχουν από το περίβλημα του ιού σαν στέμμα (απ’όπου βγαίνει και το όνομα των κορονοϊών) και προσδένονται σε υποδοχείς του υποψήφιου κυττάρου-ξενιστή.

Οι άνθρωποι δεν χρειαζόμαστε όλα αυτά τα μοριακά εργαλεία- γι’αυτό και δεν έχουμε γενετικές οδηγίες για αυτά στο DNA μας. Έτσι όταν οι ειδικοί βρίσκουν αυτά τα RNA σε ένα άτομο, αποτελούν ένδειξη ότι έχει προσβληθεί από τον ιό.

Πώς όμως ψάχνει κανείς για το RNA του ιού; Υπάρχουν αρκετά εμπόδια, το βασικότερο εκ των οποίων είναι ότι, ακόμα και όταν υπάρχει μεγάλο ιικό φορτίο σε έναν φορέα, η συνολική ποσότητα του RNA είναι απειροελάχιστη. Και για να μας δυσκολέψει ακόμα περισσότερο, το RNA είναι εξαιρετικά ασταθές-οπότε στη διαδικασία απομόνωσής του χάνεις αρκετό από το υλικό με το οποίο ξεκίνησες.

Πώς ξεπερνάμε αυτά τα εμπόδια; Χρειαζόμαστε πολύ ευαίσθητες μεθόδους για να ανιχνεύσουμε το RNA του ιού και να το ξεχωρίσουμε από όλα τα άλλα μόρια RNA&DNA (αλλιώς γνωστά και ως «νουκλεϊκά οξέα» ) που βρίσκονται στον οργανισμό. Ένας τρόπος να το κάνουμε αυτό είναι να ενισχύσουμε το «σήμα» που μας ενδιαφέρει χωρίς να ενισχύουμε το «θόρυβο», δηλαδή να φτιάξουμε αντίγραφα μόνο της γενετικής πληροφορίας του ιού, αυξάνοντας μαζικά την ποσότητά τους!

Ευτυχώς η επιστήμη έχει εδώ και μισό αιώνα κατακτήσει τη γνώση  που μας επιτρέπει να χρησιμοποιούμε την DNA Πολυμεράση για να φτιάχνουμε μαζικά αντίγραφα από συγκεκριμένες αλληλουχίες γενετικού υλικού in vitro (σε δοκιμαστικό σωλήνα), χρησιμοποιώντας μια μέθοδο που λέγεται Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, η γνωστή και ως PCR).  Οι αλληλουχίες DNA που θέλουμε να αντριγράψουμε επιλέγονται με βάση μικρά κομματάκια DNA που ονομάζονται «εκκινητές» (primers) και είναι σχεδιασμένα να «κολλάνε» στα σημεία του DNA όπου θέλουμε να ξεκινήσει και να σταματήσει η αντιγραφή (ένας εκκινητής ανά αλυσίδα της διπλής έλικας). Η PCR αποτελεί μια σειρά κύκλων χημικών αντιδράσεων όπου εναλλάσονται οι αντιδράσεις Αποδιάταξης- όπου αυξάνουμε τη θερμοκρασία για να «ξεκολλήσουν» οι δύο αλυσίδες του DNA -> Υβριδισμού-το στάδιο που προσδένονται οι εκκινητές στις δύο αλυσίδες του DNA-> Επιμήκυνσης- η DNA πολυμεράση αντιγράφει την αλληλουχία που θέλουμε και μας δίνει ένα νέο δίκλωνο μόριο DNA, το οποίο θα αποδιαταχθεί με την αύξηση της θερμοκρασίας στον επόμενο κύκλο, σαν φερμουάρ που ανοίγει,  ξεκινώντας τη διαδικασία πάλι από την αρχή!

Αλλά οι DNA Πολυμεράσεις που χρησιμοποιούμε είναι DNA-εξαρτώμενες DNA πολυμεράσες- ένα τεράστιο όνομα που απλώς σημαίνει ότι φτιάχνουν αντίγραφα DNA από «καλούπια» DNA. Κάτι που μας φέρνει αντιμέτωπους με το πρόβλημα νούμερο 2: Ο SARS-Cov-2 είναι RNA ιός!!!

But the DNA Pols we use are DNA-dependent DNA polymerases – a mouthful of a phrase that just means that they make DNA copies from DNA templates. Which brings us to problem number 2: SARS-Cov-2 is an RNA virus?!

Ευτυχώς, υπάρχει λύση ΚΑΙ για αυτό, και εδώ είναι που μπαίνει στο παιχνίδι το “RT” της RT-PCR. Το RT είναι συντομία του Reverse Transcription, που σημαίνει Αντρίστροφη Μεταγραφή, και είναι η διαδικασία δημιουργίας ενός αντιγράφου DNA από ένα αρχικό RNA. Ονομάζεται «αντρίστροφη» μεταγραφή γιατί η διαδικασία αντιγραφής από ένα αρχικό DNA σε RNA ονομάζεται μεταγραφή, και είναι ο τρόπος με τον οποίο τα κύτταρά μας φτιάχνουν RNA αντίγραφα του DNA για να τα χρησιμοποιήσουν ως οδηγίες κατασκευής πρωτεΐνών (σκεφτείτε το σαν να βγάζεις «φωτοτυπίες» RNA από το τεράστιο «βιβλίο» του DNA).

Έτσι, πριν φτάσουμε αντίδραση PCR, μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε μια «αντίστροφη μεταγραφάση» ένα ένζυμο που θα φτιάξει συμπληρωματικά αντίγραφα DNA του ιικού RNA, και τώρα έχουμε DNA που η DNA πολυμεράση ευχαρίστως θα μας αντιγράψει εάν της παρέχουμε κατάλληλους εκκινητές.

Όμως ακόμα χρειαζόμαστε έναν τρόπο να ανιχνεύουμε τα αντίγραφα που φτιάχνουμε. Αυτό γίνεται χρησιμοποιώντας φθορίζοντα μόρια-«ανιχνευτές» (probes) που είναι κάπως σαν τους εκκινητές- απ’την άποψη ότι κι αυτοί είναι μικρά κομματάκια DNA που προσδένονται ειδικά στην περιοχή που μας ενδιαφέρει. Αλλά αντί να προσδένονται στα άκρα, προσδένονται κάπου στη μέση της περιοχής που αντιγράφεται και μας «ενημερώνουν» ότι έχει παραχθεί ένα αντίγραφο. Ο τρόπος που δουλεύουν έχει πολύ ενδιαφέρον, οπότε αν μείνετε στην παρέα μας, σε λίγο θα σας δώσω μερικές ακόμα λεπτομέρειες.

Τα ζεύγη εκκινητή/ανιχνευτή μας επιτρέπουν να ψάχνουμε για τις μικρές αλληλουχίες βάσεων-«γραμμάτων» στο ιικό γονιδίωμα που έχει ο ιός αλλά όχι εμείς (όπως είναι μέρη των γονιδίων Ν,Ε και RdRP). Αλλά για να μπορέσουμε να βρούμε αυτές τις μικρές αλληλουχίες ιικού RNA πρέπει πρώτα να βρούμε το ιικό RNA. Πού θα το ψάξουμε; Τα τεστ γίνονται συνήθως σε επιχρίσματα από τη μύτη ή το λαιμό/φάρυγγα (γνωστά και ως ρινοφαρυγγικά ή οροφαρυγγικά επιχρίσματα, αντίστοιχα). Μπορεί επίσης να σας ζητηθεί να βήξετε λίγο πτύελο (κοινώς φλέγμα) για ένα δείγμα του «κατώτερου αναπνευστικού».

Με όλη αυτή την ενημέρωση γύρω από την COVID-19, είναι εύκολο να ξεχάσουμε ότι η γρίπη (influenza) και το απλό κοινό κρυολόγημα εξακολουθούν να διασπείρονται (ένας από τους λόγους που υπάρχει τεράστιο όφελος για τη δημόσια υγεία από τη μείωση του αριθμού ή απλώς καθυστέρηση διασποράς των κρουσμάτων COVID-19 είναι ότι οι υπηρεσίες υγείας εξακολουθούν να εξυπηρετούν ασθενείς με γρίπη και δεν έχουν χωρητικότητα για την αυξημένη εισροή ασθενών που χρειάζονται μηχανική αναπνευστική υποστήριξη και άλλο εξοπλισμό (και γιατρούς, νοσηλευτές, κρεβάτια κοκ). Οπότε σας ενθαρρύνω σθεναρά να συμμετέχετε στην προσπάθεια «εξομάλυνσης της καμπύλης» και να μείνετε σπίτι. Μπορείτε να βρείτε περισσότερες πληροφορίες εδώ (στα Αγγλικά): https://www.npr.org/sections/health-shots/2020/03/13/815502262/flattening-a-pandemics-curve-why-staying-home-now-can-save-lives

Ο λόγος που αναφέρω αυτές τις (στατιστικά πιο πιθανές στις περισσότερες περιπτώσεις) αιτίες του πονόλαιμου ή του βήχα σας είναι ότι είναι πολύ σημαντικό να τις αποκλείσουμε και, ακόμα και αν δεν είναι COVID-19, εσείς (και οι επιδημιολόγοι) θέλετε να ξέρετε τι πραγματικά προκαλεί τα συμπτώματά σας. Έτσι οι ειδικοί μπορεί να κάνουν τεστ για αυτούς τους ιούς πριν από ή σε συνδυασμό με τον SARS-Cov-2. Αυτό μπορεί να γίνει εάν συμπεριλάβουμε ζεύγη εκκινητών/ανιχνευτών που στοχεύουν εκείνους τους ιούς ή αν προσθέσουμε διαφορετικά τεστ. Ένα προχωρημένο παράδειγμα είναι  το τεστ “BioFire”- είναι ένα τεστ που βασίζεται σε ολοκληρωμένο κύκλωμα «τσιπάκι» και μπορεί να κάνει εκατοντάδες αντιδράσεις PCR σε διαφορετικά κελιά του ίδιου κυκλώματος. Μπορεί έτσι να ελέγξει για να μεγάλο αριθμό αναπνευστικών λοιμώξεων ταυτόχρονα- οι 21 λοιμώξεις που ελέγχει δεν περιλαμβάνουν τον SARS-Cov-2, αλλά η κατασκευάστρια εταιρεία BioMérieux εργάζεται για να το προσθέσει.

Προς το παρόν, ας επικεντρωθούμε στα ήδη διαθέσιμα τεστ- τα τεστ του CDC στις ΗΠΑ χρησιμοποιούν ανιχνευτές “TaqMan”. Αυτοί οι «διπλοί ανιχνευτές υδρόλυσης» λειτουργούν χρησιμοποιώντας ένα φαινόμενο που ονομάζεται FRET. Μην αγχώνεστε αν δεν ξέρετε τι στο καλό είναι αυτό- θα σας εξηγήσω. FRET είναι τα αρχικά των λέξεων Forster Resonance Energy Transfer, ένα κουλ φαινόμενο που μας επιτρέπει να καταλάβουμε εάν δύο μόρια είναι κοντά το ένα με το άλλο. Ένα μόριο, η φθορίζουσα ομάδα (fluorophore) έχει την ικανότητα να εκπέμπει φως, αλλά μόνο εάν το άλλο μόριο, η ομάδα απόσβεσης (quencher) δεν βρίσκεται δίπλα του.

Ε, στους ανιχνευτές, είναι δίπλα του (τουλάχιστον στην αρχή…) Και μια που μιλάμε για αρχή- η φθορίζουσα ομάδα (μια χημική ομάδα που ονομάζεται FAM(6-καρβόξυ-φλουορεσκεΐνη) στους ανιχνευτές του CDC) βρίσκεται στην αρχή του ανιχνευτή (αυτό που ονομάζουμε το 5’ άκρο) και η ομάδα απόσβεσης (με το εξαιρετικό όνομα BHQ ή Black Hole Quencher, στους ανιχνευτές του CDC) βρίσκεται στην άλλη άκρη του ανιχνευτή (το 3’ άκρο). Οι ανιχνευτές έχουν μήκος μόλις 20 βάσεις, πάνω κάτω, οπότε η ομάδα απόσβεσης είναι αρκετά κοντά στη φθορίζουσα ομάδα για να το εμποδίσει να λάμψει (είναι μόνο μερικά νανόμετρα μακριά, δηλαδή σε απόσταση 100,000 μικρότερη από το πάχος μιας τρίχας).

Το φως είναι μια μορφή ενέργειας και διαφορετικά μήκη κύματος φωτός έχουν διαφορετική ενέργεια. Αν έχεις μια φθορίζουσα ομάδα και τη φωτίσεις με φως μήκους κύματος που της «αρέσει», τότε η φθορίζουσα ομάδα απορροφά το φως και μπαίνει σε μια «διεγερμένη κατάσταση»- αλλά είναι δύσκολο να μείνεις σε διέγερση για πολύ, οπότε προσγειώνεται και επιστρέφει μέρος της ενέργειας που απορρόφησε ως φως που μπορούμε να ανιχνεύσουμε!

Αλλά το φως δεν είναι ο μόνος τρόπος μεταφοράς ενέργειας- ένας άλλος τρόπος είναι μέσω του φαινομένου FRET. Εάν στην ομάδα απόσβεσης «αρέσει» η ενέργεια που κανονικά μας «επέστρεφε» η φθορίζουσα ομάδα και ταυτόχρονα η φθορίζουσα ομάδα και η ομάδα απόσβεσης βρίσκονται αρκετά κοντά μεταξύ τους, η ομάδα απόσβεσης μπορεί να απορροφήσει την ενέργεια που η φθορίζουσα ομάδα θα εξέπεμπε ως φως- έτσι «αποσβαίνει» το φθορισμό. http://bit.ly/2m5hpfh

Αλλά για να συμβεί αυτή η απόσβεση, η φθορίζουσα ομάδα και η ομάδα απόσβεσης πρέπει να είναι κοντά μεταξύ τους. Όταν χωρίζονται, η φθορίζουσα ομάδα είναι ελεύθερη να λάμψει!

Και χωρίζονται όταν το DNA πάνω στο οποίο είναι προσδεδεμένα αντιγράφεται, επειδή η DNA πολυμεράση που χρησιμοποιείται για την αντιγραφή, η Taq πολυμεράση, έχει δραστικότητα 5’νουκλεάσης- μπορεί να κόβει δηλαδή DNA. Έτσι, αν πάει να αντιγράψει ένα τμήμα DNA και πέσει πάνω σε ένα «οδόφραγμα» ανιχνευτή, η Taq μπορεί να «καταβροχθίσει» τον ανιχνευτή όταν τον συναντά. Αυτό επιτρέπει στην Taq να διώξει τον ανιχνευτή και να συνεχίσει την αντιγραφή της- και ταυτόχρονα χωρίζει τη φθορίζουσα ομάδα από την ομάδα απόσβεσης, και μας επιτρέπει να δούμε το φως που εκπέμπεται.

Και είναι αυτό το φως που μας δίνει το σήμα ότι δημιουργήθηκε ένα αντίγραφο-αφού η Taq μπορεί να συναντήσει τον ανιχνευτή «μόνο» αν αντιγράφει το DNA πάνω στο οποίο αυτός βρίσκεται (δηλαδή θεωρητικά θα μπορούσαν να συναντηθούν οπουδήποτε, αλλά αυτό είναι αρκετά απίθανο εκτός και αν τα φέρει κοντά η διαδικασία της αντιγραφής). Η δημιουργία ενός αντιγράφου σημαίνει ότι η αλληλουχία-στόχος (όπως ένα ιικό γονίδιο) ήταν παρούσα στο δείγμα για να αντιγραφεί, και αποτελεί ένδειξη λοίμωξης.

Όμως, αφού ξεκινάμε με τόσο λίγα αντίγραφα στην αρχή, η ποσότητα φθορισμού που εκπέμπεται είναι αρχικά πολύ χαμηλή- και δεν ξεχωρίζει από το υπόβαθρου σήματος «θορύβου», οπότε πρέπει να την ενισχύσουμε.

Αλλά και σ’αυτό υπάρχει λύση: ανάμεσα σε κάθε κύκλο αντιγραφής, έχουμε ένα ακόμα βήμα αποδιάταξης όπου οι αλυσίδες χωρίζονται, και αυτό επιτρέπει σε «αμάσητο» ανιχνευτή (με ενεργή απόσβεση) να προσδεθεί κατά το βήμα υβριδισμού (οι εκκινητές επίσης προσδένονται σε αυτό το βήμα). Και όταν μπαίνουμε στη φάση επιμήκυνσης, όπου αντιγράφεται το DNA, η Taq συναντά και καταβροχθίζει λίγο ανιχνευτή ακόμα. Έτσι περισσότερα φθορίζοντα μόρια «απελευθερώνονται» και βλέπουμε περισσότερο φθορισμό.

Αφού κάθε αλυσίδα χρησιμοποιείται για να φτιάξει 1 αντίγραφο σε κάθε κύκλο, πάμε από 2->4->8->16->32 κοκ (εκθετική καμπύλη) οπότε βλέπουμε εκθετική αύξηση στο σήμα φθορισμού μέχρι κάτι να τελειώσει (ανιχνευτής, εκκινητές, νουκλεοτίδια κλπ). Όσα περισσότερα αντίγραφα είχαμε στην αρχή, τόσο πιο γρήγορα θα αυξηθεί η εκπομπή φθορισμού- οπότε μπορούμε να ορίσουμε ένα «όριο αναφοράς» για το επίπεδο φθορισμού και μετά να δούμε «πόσο γρήγορα» διαφορετικοί συνδυασμοί δειγμάτων/εκκινητών/ανιχνευτών φτάνουν στο όριο αναφοράς. Με το «πόσο γρήγορα» εννοούμε συνήθως αριθμό κύκλων αντιγραφής.

Εάν δημιουργήσουμε ένα γράφημα που δείχνει #κύκλων ως προς ποσότητα φθορισμού, θα πάρουμε μια καμπύλη σαν πλάγιο μπαστούνι- εντάξει, δεν υπάρχει καλός τρόπος να το περιγράψεις (απλά δείτε την εικόνα…)

Αυτό που ψάχνουμε είναι ένας αριθμός που ονομάζεται CT και είναι ο αριθμός των κύκλων που χρειάζονται για να ξεπεραστεί ένα «όριο ανίχνευσης» που αντιστοιχεί στο σήμα φθορισμού υποβάθρου (θόρυβο)- όταν ξεπεραστεί αυτό το όριο σημαίνει ότι είσαι «πάνω από το υπόβαθρο»- και ξέρεις ότι έχεις πραγματικό σήμα ακτινοβολίας φθορισμού και όχι απλά θόρυβο. Είναι δύσκολο να το καταλάβεις στους πρώτους κύκλους γιατί έχεις τόσο λίγο DNA που αντιγράφεται, αλλά όσα περισσότερα αντίγραφα βρίσκονται στην αρχική σου «απειροελάχιστη ποσότητα» τόσο πιο γρήγορα (σε λιγότερους κύκλους) θα ξεπεράσεις το όριο ανίχνευσης.

Οπότε, η RT-PCR χρησιμοποιείται συνήθως για να μας πει πόσα αντίγραφα βρίσκονται αρχικά στο δείγμα (όχι τόσο μια «ναι ή όχι» απάντηση, αλλά μια «πόσο πολύ» απάντηση). Αλλά με αυτά τα τεστ, ο αριθμός αντιγράφων αρχικά στο δείγμα δεν μας λέει πολλά γιατί εξαρτάται από παράγοντες όπως πόσο πολύ RNA είχαμε στο δείγμα και αν κάποιο από αυτό χάθηκε στην πορεία (είπαμε, είναι ευαίσθητο), κλπ. Αντί γι’αυτό θες μια θετική ή αρνητική απάντηση, οπότε ένα όριο ανίχνευσης ορίζεται και εάν ένας συνδυασμός δείγματος/αλληλουχίας στόχου ξεπερνάει αυτό το όριο, το τεστ θεωρείται θετικό για το στόχο αυτό. Όμως το αν το τεστ θεωρείται θετικό γενικά εξαρτάται από το πώς τα πήγαν οι άλλοι στόχοι.

Τα τεστ συνήθως «ψάχνουν» για τουλάχιστον δύο ειδικά τμήματα γονιδίων του SARS-Cov-2, για να είναι πολύ, πολύ σίγουρα. Εάν και τα δύο έχουν πολλαπλασιαστεί, το τεστ είναι θετικό- εάν πολλαπλασιαστεί μόνο το ένα, το τεστ μένει χωρίς αποτέλεσμα- και εάν κανένα από τα δύο δεν πολλαπλασιαστεί, το τεστ είναι αρνητικό (αν και υπάρχει πάντα η πιθανότητα «ψευδώς αρνητικοού» αποτελέσματος, ειδικά εάν στα δείγματα υπάρξει αποσύνθεση του RNA- θυμηθείτε πόσο ευαίσθητο είναι!)

Φυσικά, όλα αυτά προϋποθέτουν ότι το «αρνητικό κοντρόλ» (ένα δείγμα RNA που δεν προέρχεται από τον SARS-CoV-2) βγαίνει αρνητικό, και το «θετικό κοντρόλ» (ένα δείγμα RNA που ξέρουμε ότι προέρχεται από τον SARS-CoV-2) βγαίνει θετικό- εάν αυτό δεν συνέβη, υπάρχει κάποιο πρόβλημα με το τεστ και τα αποτελέσματα είναι άκυρα.

Κι αυτό μπορεί να είναι ένα πραγματικά μεγάλο πρόβλημα, όπως ανακάλυψαν στις ΗΠΑ με τραγικά δύσκολο τρόπο. H RT-PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη- επειδή κάθε αρχικό μόριο RNA πολλαπλασιάζεται και ενισχύεται εκθετικά.  Έτσι ακόμα και μια απειροελάχιστη ποσότητα επιμόλυνσης μπορεί να κάνει ένα αρνητικό δείγμα να δώσει θετικό αποτέλεσμα (ένα «ψευδώς θετικό» αποτέλεσμα). Κι αυτό μπορεί να συνέβη με κάποια από τα αρχικά τεστ «κιτ» του CDC- κάποιοι συνδυασμοί εκκινητών/ανιχνευτών έδιναν ψευδώς θετικά αποτελέσματα.

Στις ΗΠΑ, μέχρι πρόσφατα, ερευνητικά εργαστήρια δεν επιτρεπόταν να κατασκευάσουν τα δικά τους τεστ για τον ιό- έτσι η διαδικασία τεστ στις ΗΠΑ καθυστέρησε και ακόμα γίνονται προσπάθειες αύξησής της. Υπάρχουν επίσης προσπάθειες για να αυτοματοποιηθεί μερικώς η διαδικασία ώστε περισσότερα τεστ να γίνονται σε μικρότερο χρόνο:  το πρωτόκολλο του CDC χρησιμοποιεί «πιάτα» PCR με 96 κυψέλες (σε μέγεθος μεγάλου smartphone, με τις κυψέλες σε μέγεθος τρύπας διατρητικού), στα οποία οι ειδικοί πρέπει να προσθέτουν τα δείγματα με το χέρι. Οπότε ακόμα και αν η PCR χρειάζεται μερικές ώρες ή και λιγότερο, η συνολική διαδικασία είναι χρονοβόρα. Αυτοματοποιημένες ή ημι-αυτοματοποιημένες μέθοδοι βοηθούν στο να αυξηθεί η ταχύτητα της διαδικασίας, αλλά χρειάζονται πιο ακριβό εξοπλισμό.

Αλλά ακόμα κι αν αυξηθεί κατά πολύ η ταχύτητα της διαδικασίας PCR, η απομόνωση του RNA του ιού είναι ακόμα πολύ περίπλοκη. Ένα βασικό πρόβλημα είναι ότι η απομόνωση RNA γίνεται συνήθως χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα «κιτ» (ένα παράδειγμα είναι το DSP Viral RNA Mini kit- διαφορετικά εργαστήρια ελέγχου χρησιμοποιούν διαφορετικά κιτ). Τα κιτ κάνουν τα πράγματα πιο εύκολα, αλλά δεν είναι απαραίτητα- απομόνωση RNA γινόταν πολύ πριν η εταιρεία Qiagen ξεκίνησε να φτιάχνει κιτ γι’αυτό. Εδώ θα βρείτε κάποιες πληροφορίες για την «παλαιάς σχολής» μέθοδο απομόνωσης RNA, που χρησιμοποιεί φαινόλη-χλωροφόρμιο για να απομονώσει RNA από άλλα συστατικά με βάση τις διαφορετικές τους διαλυτότητες: http://bit.ly/2Xj4Zyc

Τα τεστ RT-PCR ένας μόνο τρόπος να ελέγξουμε για τον ιό: με αυτά τον ανιχνεύουμε μόνο όταν κανείς βρίσκεται σε φάση ενεργού λοίμωξης, και ο ιός φτιάχνει ακόμα όλο αυτό το RNA για να κατασκευάσει τις πρωτεΐνες που χρειάζεται για να αντιγράψει τον εαυτό του και να μολύνει κι άλλα κύτταρα.

Όταν ο ιός «κατατροπωθεί» από το ανοσοποιητικό σύστημα, το ιικό RNA δεν βρίσκεται πια εκεί- όμως τα ίχνη από τις πρωτεΐνες που φτιάχτηκαν από αυτό είναι. Η ανοσολογική απόκριση που επέτρεψε στο σώμα να καταπολεμήσει τον ιό είχε ως αποτέλεσμα τη δημιουργία μικρών πρωτεΐνών που ονομάζονται αντισώματα και αναγνωρίζουν ειδικά τμήματα των πρωτεϊνών του ιού ως «ξένα» , ενεργοποιώντας την ανοσολογική απόκριση.

Μετά την αρχική μόλυνση, το σώμα χρειάζεται χρόνο για να αναπτύξει αντισώματα κατά του ιού- με μια διαδικασία κατά την οποία οι πρωτεΐνες του ιού «κομματιάζονται» και τα τμήματά τους «εκτίθενται» σε ένα «κάδρο» πρωτεΐνών που προεξέχουν από ειδικά κύτταρα του ανοσοποιητικού. Το σώμα μπαίνει σε μια διαδικασία τυχαίας «δοκιμής και σφάλματος» ώστε να φτιάξει αντισώματα που αναγνωρίζουν και προσδένονται σε αυτά τα τμήματα ιικών πρωτεϊνών. Αφού τελειώσει «ο διαγωνισμός» φτιάχνει μεγάλες ποσότητες των αντισωμάτων που αναγνωρίζουν με επιτυχία τον ιό. Περισσότερα εδώ (στα Αγγλικά): http://bit.ly/antibodytypesuses

Κάποια από αυτά τα αντισώματα παραμένουν και μετά την ολοκλήρωση της λοίμωξης για να «φυλάνε σκοπιά». Έτσι,αν ο ίδιος ιός ξαναπροσπαθήσει να εισβάλει, το ανοσοποιητικό σύστημα δεν χρειάζεται να ξαναπεράσει την ίδια διαδικασία για να φτιάξει τα κατάλληλα αντισώματα. Άρα τεστ που ψάχνουν για αντισώματα μπορούν να δουν αν κάποιος είχε τον ιό στο παρελθόν, ακόμα και αν έχει αναρρώσει. Μ’αυτό τον τρόπο μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση των κρουσμάτων ώστε να εντοπιστεί η αλυσίδα μετάδοσης του ιού από άνθρωπο σε άνθρωπο, ακόμα και αν οι φορείς είναι πλέον ασυμπτωματικοί και δεν έχουν το RNA που ανιχνεύεται με τα τεστ RT-PCR.

Τα τεστ αντισωμάτων είναι πιο γρήγορα και γίνονται κατά κύριο λόγο σε δείγματα αίματος. Το μειονέκτημά τους είναι ότι, εφόσον προέρχονται από την πετυχημένη προσπάθεια του ανοσοποιητικού να στοχοποιήσει τον ιό, δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευσή του τόσο νωρίς στην εξέλιξη της ασθένειας όσο τα τεστ RT-PCR.

Τα εμβόλια δουλεύουν χρησιμοποιώντας μη-μολυσματικό ιό ή τμήματα του ιού για να ενεργοποιήσουν το ανοσοποιητικό σύστημα ώστε το σώμα να μπει στη διαδικασία «δοκιμής και σφάλματος» για να φτιάξει αντισώματα που αναγνωρίζουν τον ιό. Έτσι ο ιός μπαίνει στη «λίστα υπόπτων» χωρίς να χρειαστεί να περάσουμε πρώτα την ασθένεια- επιστήμονες σε όλο τον κόσμο εργάζονται ακατάπαυστα για να δημιουργήσουν ασφαλή, αποτελεσματικά εμβόλια κατά του SARS-Cov-2, αλλά θα χρειαστεί αρκετός χρόνος- τα εμβόλια όχι μόνο πρέπει να αναπτυχθούν αλλά και να ελεγχθούν για την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητά τους.

Ελπίζω αυτό το ποστ να σας βοήθησε να καταλάβετε τι συμβαίνει- και μιας που λέμε για βοήθεια, ήθελα να είμαι απόλυτα σίγουρη ότι σας δίνω τις πιο ακριβείς πληροφορίες διαθέσιμες αυτή τη στιγμή, οπότε πήρα «τη βοήθεια του κοινού» από μερικούς φίλους: Ευχαριστώ την Katie Meze, και τους Δρ. Alexandra Newton, Δρ. Justin Kinney, Δρ. Charles Murtaugh και Δρ. Elisa Zhang.

Και ευχαριστώ όλους εσάς και όσους συμμετέχουν στην εξομάλυνση της καμπύλης! *Κόλλα πέντε από απόσταση!*


Ένα μεγάλο ευχαριστώ στην Nefeli Boni-Kazantzidou. Η Νεφέλη είναι διδακτορική φοιτήτρια στο Πανεπιστήμιο του Λίβερπουλ

Leave a Reply

Your email address will not be published.